Oparte na sekwencjach odkrycie Bradyrhizobium enterica w zespole Cord Colitis Syndrome AD 5

Użyliśmy narzędzia PhyloPhlAn (http://huttenhower.sph.harvard.edu/phylophlan) do wykonania ukorzenionej analizy filogenetycznej na podgrupie 400 rdzeniowych genów, a następnie analizy bootstrap w celu określenia siły przewidywanych asocjacji filogenetycznych. Przeprowadzono analizę porównawczą genomową (szczegóły patrz Suplement Dodatek). Globalne dopasowanie sekwencji aminokwasów przeprowadzono za pomocą algorytmu Needlemana-Wunscha, 24 i procent identyczności pomiędzy każdym genem B. enterica i jego najbliższym homologiem w B. japonicum.
Amplifikacja PCR kontroli docelowej i ludzkiej aktyny B. enterica
Startery do testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zaprojektowano wobec słabo konserwatywnego regionu tymczasowego genomu B. enterica z użyciem PrimerQuest (Integrated DNA Technologies) i wygenerowano. Te primery (starter przedni, 5 -TCGAGGGCTACGGCTTGAAGATTT-3 , primer odwrotny, 5 -ACAACGTGTTGCCGCCAATATGAG-3 ) wzmacniają cel 367-bp, który obejmuje region międzygenowy (superkontriga 17 w pozycji pary zasad 152,156-152,522). Startery ukierunkowane na gen ludzkiej aktyny (starter przedni, 5 -GCGAGAAGATGACCCAGATC-3 , primer odwrotny, 5 -CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3 ) wzmacniają docelowy 102-bp. Szczegółowy opis warunków PCR znajduje się w Dodatku Uzupełniającym.
Analiza FISH
Zastosowaliśmy fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) w celu przeprowadzenia eksperymentów na utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbkach z biopsji okrężnicy, uzyskanych od pacjentów z zapaleniem okrężnicy przewodu pokarmowego oraz z grupy kontrolnej. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie ze sposobem Świdińskiego, zarówno z sondą specyficzną dla bradyrhizobium, jak i sondą eubakteryjną (uniwersalną bakteryjną) .5,5,26 (Dodatkowe uzupełnienie zawiera szczegółowe opisy metod FISH i eksperymentów konkursowych w celu wykazania swoistości sondy bradyrhizobium.)
Wyniki
Sekwencjonowanie Shotgun i analiza PathSeq
DNA wyekstrahowano z czasowo różniących się próbek z biopsji okrężnicy od Pacjentów 5 i 11 (próbki 5b i 5c oraz próbki 11b i 11d) (Tabela 1) i stosowano do masowo równoległego sekwencjonowania (Figura 1). Biblioteki kodowane na pasku zostały przygotowane i poddane sekwencjonowaniu na platformie Illumina V3.19 Sekwencyjne obliczeniowe odjęcie ludzkich odczytów i znanych odczytów mikrobiologicznych (w tym bakterii, archeonów, wirusów i grzybów) przeprowadzono przy użyciu PathSeq (tabela S1 w Dodatek uzupełniający) .19 Wszystkie dane dotyczące nieludzkich odczytów są przechowywane w archiwum NCBI Sequence Read Archive (numer przedłożenia, SRS386798). Ponad 2,5 miliona odczytów pozostało bez mapowania, co sugeruje obecność obfitych sekwencji, których nie ma w bazach danych referencyjnych.
Zgromadzenie genomu i porównawcza analiza genomu
Połączony zestaw nieczłowiecznych odczytów z próbek 11b i 11d został poddany de novo assembly.20,21 Oprogramowanie ALLPATHS wygenerowało największą liczbę kontigów całkowitych, które miały ponad 2,5 kb długości
[więcej w: medicus jawor rejestracja, lekarz medycyny pracy warszawa centrum, przywileje dawcy krwi ]

Tags: , ,

Comments are closed.

Powiązane tematy z artykułem: lekarz medycyny pracy warszawa centrum medicus jawor rejestracja przywileje dawcy krwi